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M5 Universal DNA Mini Kit

使用说明书

【储存条件】

室温储存 12 个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在 37˚C 水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。

【产品简介】

本试剂盒利用聚合美独特的结合液/蛋白酶 K 迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的， 抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组 DNA 从硅基质膜上洗脱。

【产品特色】

1.   离心吸附柱内硅基质膜全部采用 Whatman 特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好，产量高。

2.   不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在 30 分钟内完成。

3.   多次柱漂洗确保高纯度，典型的产量 200µl 全血可提取出 3-6µg，OD260/OD280典型的比值达 1.7～1.9，长度可达 30 kb -50kb，可直接用于 PCR、Southern-blot 和各种酶切反应。

【产品组份】

【注意事项】

1.   所有的离心均在室温完成，使用转速可以达到 13,000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2.   需要自备 1x PBS(磷酸盐缓冲液)和异丙醇。

3.   不同样品尤其疾病样品中白细胞数量差异可能非常大，因此产量的个体差异也可能非常大。

4.   开始实验前将需要的水浴先预热到 70℃备用。

5.   为了最佳效果，最好使用新鲜血液标本或者 4˚C 存放少于 3 天的标本，不要使用反复冻融超过 3 次的标本，否则会严重降低产量。

【平衡液使用】

1.核酸吸附硅胶膜柱子长期放置过程中会同空气中的电荷/尘埃发生反应而影响其核酸的结合能力。硅胶柱经平衡液预处理后可大大减少柱子中硅胶膜的憎水基团，提高核酸的结合能力。从而提高硅胶柱子回收效率或者产量。平衡液是强碱性溶液，若不小心碰到，请用大量自来水清洗。用完后需盖紧瓶盖，以免接触空气。室温保存。在保存过程中可能有沉淀生成，请加热至 37℃使沉淀完全消失。

2.使用方法：（临用前才预处理）取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取 100μl 的平衡液至柱子中。13,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。此时平衡液预处理柱子完毕。接后续的操作步骤。

【操作步骤】

<第一次使用前请先在漂洗液WB中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!> <使用平衡液预处理硅胶膜吸附柱为必做步骤，具体方法参见前面“平衡液的使用”>

1.    全血样品

a. 取 200ul 新鲜、冷冻或加入各种抗凝剂的血液，放入 1.5ml 离心管。

如果全血起始量小于 200μl，则用缓冲液 BB 补足到 200μl。如果起始量介于 200μl-300μl 之间，则后续操作需要按照比例增加试剂用量。如果起始量介于 300μl-1ml 之间，则需要先进行红细胞裂解操作（见本说明书后附录）。

如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量 5-20μl，可加缓冲液 BB 补足

到 200μl 后进行后续步骤。

b.加入 20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在 70˚C 放置 10 分钟。溶液应变清亮（但颜色偏黑色）。

<可选：如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可以在加入 200μl 结合液 CB 前加 20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟>。

c.   冷却后加 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

<上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡 15 秒混匀>。

d.   将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液。

e.   接操作步骤项下 5。

2.   组织培养细胞

a.   收集约 10⁵-10⁶悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管；对于贴壁细胞，应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。

b.   13,000rpm 离心 10 秒，使细胞沉淀下来。弃上清，留下细胞团和大约 10-20μl 残留的液体。

c.   加 200μl 1x PBS 重悬洗涤细胞，13,000rpm 离心 10 秒，使细胞沉淀下来。完全吸弃上清, 将细胞沉淀重悬于 180μl 1x PBS 中。

d.   加入20μl 蛋白酶 K (20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，在 70˚C 放置 10 分钟。

<可选：如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可以在加入 200μl 结合液 CB 前加 20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟>。

e.   冷却后加 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

f.   将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液。

g.   接操作步骤项下 5。

3.   动/植物组织（例如鼠肝脑或者植物叶片）

a.   将 20-50mg 新鲜或者解冻的组织用解剖刀切成小碎块（切成小块可以提高产量）或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中，用大口径枪头吹打混匀。

b.   加入 20μl 的蛋白酶 K 溶液(20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

c.   将裂解物放置在 55˚C 水浴 1-3 小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

<可选: 如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A(25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟>。

d.   加入 200μl 结合液 CB，立刻涡旋振荡充分混匀，70˚C 放置 10 分钟。

e.   冷却后加 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

f.   用 1ml 的枪头吸取混合物，加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 60 秒，倒掉收集管中的废液。

<如果有不溶组织物可能堵住枪头，可将枪头在吸水纸上轻蹭去除不溶物；如果吸上来的混合物少则可以将枪头和不溶物一起弃去，该做法是为了去除不溶物，以免堵塞离心柱>。

g.   接操作步骤项下 5。

4.   动物组织（鼠尾）

a.   将 0.2-0.5cm 的鼠尾巴尖(即 20-50mg)剪碎（一定要剪 0-2cm 范围内的尾巴尖，否则裂解效果不好），或者在液氮中研磨组织成细粉后，转入装有 180μl 组织裂解液 TL 的 1.5ml 离心管中， 用大口径枪头吹打混匀。

b.   加入 20μl 的蛋白酶 K (20mg/ml)，立刻涡旋振荡充分混匀。

c.   将裂解物放置在 55˚C 水浴 3 小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解。

<可选: 如果 RNA 残留较多，需要去除 RNA，可在完成步骤 c 后加 20μl RNase A (25mg/ml)溶液，振荡混匀，室温放置 5-10 分钟>。

d.   用一个 1ml 不带针头的一次性输液器抽打裂解物 2-3 次。

e.   加入200μl 结合液 CB 和 100μl 异丙醇，立刻涡旋振荡充分混匀。

<上述步骤中立刻涡旋或者吹打充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时如样品粘稠不易混匀时可以涡旋振荡 15 秒混匀>。

f. 13,000rpm 离心 5 分钟，将上清加入吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）13,000rpm 离心 30-60 秒，倒掉收集管中的废液。

g. 接操作步骤项下 5。

5.   加入 500μl 抑制物去除液 IR，12,000rpm 离心 30 秒，弃废液。

6.加入 600μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

7.加入 600μl 漂洗液 WB，12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

8.将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

9.取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液 EB （洗脱缓冲液事先在 65-70˚C 水浴中预热）， 室温放置 3-5 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置 2 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。

<洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于 50μl，体积过会降低 DNA 洗脱效率和得率>。

10.   DNA 可以存放在 2-8˚C，如果要长时间存放，可以放置在-20˚C。

【备注】

本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。