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MJM5 HiPer Universal DNA Mini Kit

使用说明书

【储存条件】

室温储存 12 个月。

【产品简介】

本试剂盒适合于从新鲜或冷冻的动物组织，细胞，血液，细菌等多种样品中提取高纯度总 DNA。本品可纯化获得分子量最大为 50kb

的DNA 片段，纯化过程不需要使用苯酚或氯仿等有毒溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的 DNA 高效特异的结合到硅基质离心吸附柱上，PCR 和其他酶促反应的抑制剂可通过两步洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可得到高纯度 DNA。纯化得到的 DNA 可以直接用于酶切，PCR，Real-Time PCR，文库构建，Southern Blot，分子标记等下游实验。

【自备试剂】

无水乙醇

Enzymatic LysisBuffer（提取革兰氏阳性菌基因组 DNA 时须准备）。

Enzymatic LysisBuffer 配方：20 mM Tris，pH 8.0；2 mM Na2-EDTA；1.2％Triton X-100；终浓度为20mg/ml 的 Lysozyme（溶菌酶）。

【产品组份】

【实验前准备及重要注意事项】

1.   向 Proteinase K（25mg）中加入指定用量的 Proteinase K Storage Buffer（1.25ml）使其溶解，-20˚C 保存。配制好的 Proteinase K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2.   样品应避免反复冻融，否则会导致提取 DNA 片段较小且提取量下降。

3.   如果提取次生代谢产物大量积累或细胞壁厚的细菌培养物的基因组，建议在对数生长期早期收集样品。

4.   第一次使用前应按试剂瓶标签的说明在BufferGW1和Buffer GW2中加入无水乙醇。

5.   使用前请检查 Buffer GTL 和 Buffer GL 是否出现结晶或沉淀，如有结晶或沉淀，请将 Buffer GL 和 Buffer GTL 于 56˚C 水浴重新

溶解。

6.如果下游实验对 RNA 污染比较敏感，可以在加入 Buffer GL 前加入 4μl DNase-Free 的 RNase A（100mg/ml），RNase A 本试剂盒并未提供，可单独订购。

【操作步骤】

血液及细胞样本基因组提取

1.    材料处理

a)   如果提取材料为哺乳动物抗凝血液（无核红细胞），可直接向50-200μl 新鲜或冷冻的抗凝血液样品中加入 Buffer GTL 补足至200μl。

b)   如果提取材料为禽类，鸟类，两栖类或更低级生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，取5-10μl 新鲜或冷冻的抗凝血液样品，加入 Buffer GTL 补足至 200μl。

c)   贴壁培养的细胞应先处理为细胞悬液（最大提取量为5x10⁶个细胞），2000 rpm（400xg）离心5分钟，弃尽上清，加200μl GTL，振荡至样品彻底悬浮。

注意：如需去除 RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl 浓度为100mg/ml 的 RNase A 溶液，涡旋15秒，室温放置2分钟。

2.    加入20μl Proteinase K 溶液（第一次使用按注意事项说明溶解）。

3.    加入200μl Buffer GL，涡旋振荡充分混匀，56˚C水浴10分钟。

4.    短暂离心以去除管盖内壁的水珠。加入200μl 无水乙醇，涡旋振荡充分混匀，短暂离心。

注意：1）加入 Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2）加入 Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织在加入 BufferGL 和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。

5.    上一个步骤中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400xg） 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤7。

8.    12,000 rpm 离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

9.    将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200μl Buffer GE 或灭菌水，室温放置2-5分钟，12000rpm 离心1分钟，收集 DNA 溶液，-20˚C 保存 DNA。

注意：1）如果下游实验对 pH 值或 EDTA 敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的 pH 值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其 pH 值在7.0-8.5（可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围），pH 值低于7.0时洗脱效率不高。

2）Buffer GE 在65-70˚C 水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE 或灭菌水再

次洗脱可以增加产量。

3）如果要提高 DNA 的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加 DNA 的终浓度，但可能会减少总产量。如果 DNA 的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE 或灭菌水洗脱。

4）因为保存在水中的 DNA 会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用 Buffer GE 洗脱并于-20˚C 保存。

动物组织基因组提取

1.    材料处理

如果提取材料为动物组织，取25 mg（脾组织用量应少于10mg）；如果材料为鼠尾，取一段长度为0.4-0.6 cm 的大鼠鼠尾或两段长度为0.4-0.6 cm 的小鼠鼠尾。

a.   样本进行液氮研磨或切成小块后置于1.5 ml 离心管中，加入180μlBuffer GTL，将不同样品做好标记。

b.   若使用匀浆器处理样本，匀浆前向样本中加入不超过80 μl Buffer GTL，匀浆后加入100 μl Buffer GTL。

注意：1）确保各组织的量不要超出推荐范围。

2）组织样本在加入 Buffer GTL 之前用液氮研磨或加入 Buffer GTL 用匀浆器匀浆处理，可以增加裂解效率。

2.    加入20 μl Proteinase K，涡旋震荡使样品彻底混匀。56˚C水浴，直至组织完全裂解，孵育过程中可每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样品分散。

注意：1）不同组织消化时间不同，通常 1-3 小时即可完成，鼠尾需要消化6-8 小时，必要时过夜消化，不会影响后续操作。

2）如果孵育和涡旋震荡后仍然有胶状物质，延长56˚C 孵育时间或再加入20 μl Proteinase K 消化。

3）如需去除 RNA，可在上述步骤完成后，加入4μl 的浓度为100mg/ml 的 RNase A 溶液，涡旋15秒，室温放置5-10分钟。

3.    加入200 μl Buffer GL，涡旋震荡充分混匀，70˚C水浴10分钟。短暂离心后加入200 μl 无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。注意：1）加入 Buffer GL 和无水乙醇后要立即涡旋震荡混匀。

2）加入 Buffer GL 和无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。一些组织（如脾，肺）在加入 Buffer GL 和无水乙醇后可能形成溶胶状产物，此时推荐进行剧烈震荡或涡旋处理。

4.    短暂离心，将步骤3所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（约13,400xg ）离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

5.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

6.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm。离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤6。

7.    12,000 rpm 离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切，PCR 等）。

8.   将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE 或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟，收集 DNA 溶液，-20℃保存 DNA。

注意：        1）如果下游实验对 pH值或 EDTA敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的 pH值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其 pH 值在7.0-8.5（可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围），pH 值低于7.0时洗脱效率不高。

2）Buffer GE 在65-70°C 水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl BufferGE 或灭菌水

再次洗脱可以增加产量。

3）如果要提高 DNA 的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加 DNA 的终浓度，但可能会减少总产量。如果DNA的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer

GE 或灭菌水洗脱。

4）因为保存在水中的 DNA 会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用 Buffer GE 洗脱并于-20°C 保存。

细菌基因组提取

1.    细菌样本预处理

1a. 革兰氏阴性菌

（1）   取细菌培养物1-5 ml（10⁶-10⁸个细胞，最多不超过2×10⁹个细胞）置于离心管（自备）中，12,000rpm（~13,400xg）

离心 1 分钟，尽量吸净上清。

（2）   向沉淀中加入180 μl Buffer GTL，振荡使菌体重悬。

（3） 加入20 μl Proteinase K，涡旋混匀，56°C孵育，直至菌体完全裂解，孵育过程中每隔一段时间颠倒或震荡离心管使样本分散。

注意：如需去除 RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl 浓度为100 mg/ml 的 RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置5-10

分钟。

（4）

加入 200

μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。

1b. 革兰氏阳性菌

（1）     取细菌培养物1-5ml（10⁶-10⁸个细胞，最多不超过2×10⁹个细胞）置于离心管（自备）中，12,000rpm离心 1 分钟，尽量吸净上清。

（2）     加入 180μl Enzymatic Lysis Buffer（自备）使菌体重悬。

（3）     37°C孵育 30 分钟。

（4）     加入 20μl Proteinase K涡旋震荡，充分混匀。加入 200μl Buffer GL，涡旋震荡混匀。56℃孵育 30 分钟。

注意：1）如果需要，95°C 孵育15分钟可以使病原体失活，但是95°C 孵育会造成一些 DNA 的降解。

2）如需去除 RNA，可在上述步骤完成后，加入4 μl 浓度为100 mg/ml 的 RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置 5-10 分钟。

2.    加入200 μl 无水乙醇，涡旋震荡充分混匀。

注意：加入无水乙醇后可能会产生白色沉淀，不会影响后续实验。

3.    将步骤2所得溶液（包括形成的沉淀）全部加入到已装入收集管的吸附柱（SpinColumns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

4.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

5.    向吸附柱中加入500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

注意：如需进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤5。

6.    12,000 rpm 离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的乙醇去除，乙醇的残留会影响后续的酶促反应（酶切、PCR 等）。

7.   将吸附柱置于一个新的离心管（自备）中，向吸附柱的中间部位悬空加入50-200 μl Buffer GE 或灭菌水，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟，收集 DNA 溶液，-20°C 保存 DNA。

注意：1）如果下游实验对 pH 值或 EDTA 敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的 pH 值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7.0-8.5（可以用 NaOH将水的 pH 值调到此范围），pH 值低于 7.0 时洗脱效率不高。

2）Buffer GE 在65-70°C 水浴预热，离心之前室温孵育5分钟可以增加产量；用另外的50-200 μl Buffer GE 或灭菌水

再次洗脱可以增加产量。

3）如果要提高DNA的终浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，室温放置2-5分钟，12,000 rpm 离心1分钟；若洗脱体积小于200 μl，可以增加 DNA 的终浓度，但可能会减少总产量。如果 DNA 的量小于1 μg，推荐用50 μl Buffer GE 或灭菌水洗脱。

4）因为保存在水中的 DNA 会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用 Buffer GE 洗脱并于-20℃保存。