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M5 FlexGen Blood DNA Kit (0.1-20ml)

使用说明书

【储存条件】

Buffer FG1 2-8˚C 保存，其他组分室温保存。

【试剂盒组分】

【产品简介】

本试剂盒提供了一种快速、灵活的方法，适用于新鲜或冷冻全血（用柠檬酸盐、EDTA 或肝素等抗凝剂处理过的样品）提取总 DNA，包括基因组 DNA 和线粒体DNA。本品可以灵活处理 0.1-20 ml 的全血，采用非离心柱的方法，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，有效去除蛋白、色素、脂类及其它抑制性杂质污染。整个过程在一个管中操作，减少了污染及样本混淆的风险。提取的 DNA 产量高、质量好，可直接用于 PCR、荧光定量 PCR、酶切和 Southern Blot 以及文库构建等实验。

【产品特色】

纯度高：提取的基因组 DNA 可直接用于下游 PCR、荧光定量 PCR、酶切等各种实验。

提取量大：可从 0.1-20 ml的全血中提取 DNA，无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂。

兼容性强：适用于处理各种血液和细胞样本。

【自备仪器、试剂】

异丙醇、70%乙醇。

【实验前准备及注意事项】

1．向Proteinase K 中加入指定用量（MF052-01 加入 0.3ml； MF052-04 加入 1.25ml）的 Proteinase K Storage Buffer 使其溶解， -20˚C 保存。配制好的 Proteinase K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。

2．所有离心操作均在室温下完成。

3．血液样品反复冻融，会导致提取的 DNA 片段较小且提取量下降，所得的基因组 DNA 也应尽可能避免反复冻融，以免降解。如果提取冷冻血液的基因组 DNA，建议 37˚C 水浴，迅速解冻后再进行后续操作。

4．血液样品的储存：

1）短期保存：已加入抗凝剂的血液样品可在 2-8˚C 储存最多 10 天，对于某些实验例如 Southern 杂交等，需要得到完整全长的基因组 DNA，请将血液样品在 2-8˚C 储存不超过 3 天，此时基因组 DNA 的降解程度较轻。

2）长期保存：仪加入抗凝剂的血液请置于-70˚C 保存（如果提取的是高分子量的 DNA，推荐使用 EDTA 作为抗凝剂）。

北京市昌平区回龙观龙域北街 10 号院 1 号楼四层 422-1 室（创集合大楼）                                    热线电话：（86）010-59724293

北京聚合美生物科技有限公司 Mei5 Biotechnology, Co., Ltd

【操作步骤】

一、从 100-900µl 全血中提取基因组 DNA（以 300µl 血液处理量为例）

1．取 300µl 全血于 2ml 离心管中，加入 300µl（样本等体积）Buffer FG1，上下颠倒混匀5 次，10,000xg 离心 30 秒，弃上清。

2．再向离心管中加入 450µl （1.5倍样本体积）Buffer FG1，涡旋振荡，使沉淀完全分散。10,000g 离心 30 秒，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置 2 分钟。

注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。

3．按照附表配制 Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液（比例 100：1）。

注意：此混合液最好现用现配，并在配好后 1 小时之内用完。

4．加入 150µl Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。

注意：1）如果有多个样品同时操作，加入 BufferFG2/Proteinase K 混合液立即涡旋振荡，不要等所有样品都加完了再振荡。

2）通常涡旋振荡 3-5 次，每次 5 秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋振荡后发现沉淀中含胶状物质，可以再加入 30µl Buffer FG2/Proteinase K 混合液，再次涡旋混匀。

5．65˚C 孵育 10 分钟，期间颠倒混匀数次。

注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿，说明蛋白消化完全。

6．加入 150µl 异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至出现丝状或者簇状基因组 DNA。

注意：与异丙醇完全混合对于沉淀 DNA 非常重要，如果样品中白细胞含量少，可能看不到 DNA，则至少上下颠倒离心管 20 次确保沉淀完全。

7．10,000xg 离心 5 分钟。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。少数时候沉淀可能贴壁不牢，不要吸弃沉淀。

9．加入 300µl 70%乙醇，涡旋振荡 5 秒，10,000xg 离心 5 分钟，弃上清。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

10.   把离心管倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，确保沉淀在管中。在管底可见白色的 DNA 沉淀，在极少数情况下沉淀可能会松弛，所以尽量缓慢倒掉上清。

11.   空气干燥 DNA 沉淀直至所有的液体挥发干净（至少 5 分钟）。乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切或者 PCR 等）实验，但避免过度干燥 DNA，因为过度干燥会使 DNA 难于溶解。

12.   加入 200µl Buffer GE， 低速涡旋 5 秒，65˚C 孵育 1 小时溶解 DNA，期间轻弹数次助溶，-20˚C 保存 DNA。如果 DNA 没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的 FG3 溶解 DNA，建议延长孵育时间。

二、从 1-5ml 全血中提取基因组 DNA（以 3ml 血液处理量为例）

1．取 3ml 全血于 15ml 离心管中，加入 3ml（样本等体积）Buffer FG1，上下颠倒混匀 5 次，2,500xg 离心 30 秒，弃上清。

2．再向离心管中加入 4.5ml （1.5倍样本体积）Buffer FG1，涡旋振荡，使沉淀完全分散。2,500xg 离心 5 分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置 2 分钟。

注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。

3．按照附表配制 Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液（比例 100：1）。

注意：此混合液最好现用现配，并在配好后 1 小时之内用完。

4．加入 1.5 ml Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。

注意：1）如果有多个样品同时操作，加入 Buffer FG2/Proteinase K 混合液立即涡旋振荡，不要等所有样品都加完了再振荡。2）通常涡旋振荡 3-5 次，每次 5 秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋振荡后发现沉淀中含胶状物质，可以再加入 300µl Buffer

FG2/Proteinase K 混合液，再次涡旋混匀。

5．65˚C 孵育 10-30 分钟，期间颠倒混匀数次。

注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿，说明蛋白消化完全。

北京市昌平区回龙观龙域北街 10 号院 1 号楼四层 422-1 室（创集合大楼）

热线电话：（86）010-59724293

注意：与异丙醇完全混合对于沉淀 DNA 非常重要，如果样品中白细胞含量少，可能看不到 DNA，则至少上下颠倒离心管 20 次确保沉淀完全。

7．2,500xg 离心 5 分钟。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。少数时候沉淀可能贴壁不牢，不要吸弃沉淀。

9．加入 1.5ml 70%乙醇，涡旋振荡 5 秒，2,500xg 离心 5 分钟，弃上清。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

10.   把离心管倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，确保沉淀在管中。在管底可见白色的 DNA 沉淀，在极少数情况下沉淀可能会松弛，所以尽量缓慢倒掉上清。

11.   空气干燥 DNA 沉淀直至所有的液体挥发干净（至少 5 分钟）。乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切或者 PCR 等）实验，但避免过度干燥 DNA，因为过度干燥会使 DNA 难于溶解。

12.   加入 300µl Buffer GE， 低速涡旋 5 秒，65˚C 孵育 1 小时溶解 DNA，期间轻弹数次助溶，-20˚C 保存 DNA。如果 DNA 没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的 FG3 溶解 DNA，建议延长孵育时间。

三、从 6-20ml 全血中提取基因组 DNA（以 10ml 血液处理量为例）

1．取 10ml 全血于 50ml 离心管中，加入 10ml（样本等体积）Buffer FG1，上下颠倒混匀 5 次，2,500xg 离心 5 分钟，弃上清。

2．再向离心管中加入 15ml （1.5倍样本体积）Buffer FG1，涡旋振荡，使沉淀完全分散。2,500xg 离心 5 分钟，弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上，放置 2 分钟。

注意：在极少情况下沉淀可能会松弛，所以要缓慢倒掉上清。将离心管倒置在吸水纸上，可以减少管壁上清的回流。

3．按照附表配制 Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液（比例 100：1）。

注意：此混合液最好现用现配，并在配好后 1 小时之内用完。

4．加入 5 ml Buffer FG2 与 Proteinase K 的混合液，立即涡旋混匀至溶液无团块。

注意：1）如果有多个样品同时操作，加入 BufferFG2/Proteinase K 混合液立即涡旋振荡，不要等所有样品都加完了再振荡。

2）通常涡旋振荡 3-5 次，每次 5 秒，可以使沉淀充分悬浮，如果涡旋振荡后发现沉淀中含胶状物质，可以再加入 1ml Buffer FG2/Proteinase K 混合液，再次涡旋混匀。

5．65˚C 孵育 10-30 分钟，期间颠倒混匀数次。

注意：如果样品颜色从红色变成橄榄绿，说明蛋白消化完全。

6．加入 5ml 异丙醇，上下颠倒彻底混匀直至出现丝状或者簇状基因组 DNA。

注意：与异丙醇完全混合对于沉淀 DNA 非常重要，如果样品中白细胞含量少，可能看不到 DNA，则至少上下颠倒离心管 20 次确保沉淀完全。

7．2,500xg 离心 5 分钟。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

8．弃上清，并把离心管倒置于干净的吸水纸上吸干。少数时候沉淀可能贴壁不牢，不要吸弃沉淀。

9．加入 5ml 70%乙醇，涡旋振荡 5 秒，2,500xg 离心 5 分钟，弃上清。如果沉淀贴壁不牢，可以适当延长离心时间或者增大离心力。

10.   把离心管倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，确保沉淀在管中。在管底可见白色的 DNA 沉淀，在极少数情况下沉淀可能会松弛，所以尽量缓慢倒掉上清。

11.   空气干燥 DNA 沉淀直至所有的液体挥发干净（至少 5 分钟）。乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切或者 PCR 等）实验，但避免过度干燥 DNA，因为过度干燥会使 DNA 难于溶解。

12.   加入 1ml Buffer GE， 低速涡旋 5 秒，65˚C 孵育 1 小时溶解 DNA，期间轻弹数次助溶，-20˚C 保存 DNA。如果 DNA 没有完全溶解，可室温过夜。如果使用少量的 FG3 溶解 DNA，建议延长孵育时间。

【附表：不同体积血液所需各种缓冲液用量】