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M5 Marine Animal DNA Kit
海洋动物基因组提取试剂盒使用说明书
产品名称 | 单位 | 货号 |
M5 Marine Animal DNA Kit | 50T | MF119-01 |
【储存条件】
常温运输，室温（15~30˚C）保存。
【产品简介】
本试剂盒适合于从多种海洋动物（如鱼类、虾类、贝类等）组织中提取总 DNA。纯化过程不需苯酚或氯仿等有机溶剂，无需乙醇沉淀。本试剂盒采用优化的缓冲体系使裂解液中的 DNA 高效特异的结合到硅胶质离心吸附柱上，其他污染物可流过膜，蛋白、PCR 和其他
酶促反应的抑制剂可通过两步有效的洗涤步骤被有效去除，最后使用低盐缓冲液或水洗脱，即可获得高纯度 DNA。纯化得到的 DNA 可以直接用于酶切、PCR、Real-Time PCR、文库构建、Southern Blot、分子标记等下游实验。
【产品组份】
50T | |
Buffer GTL | 15 ml |
Buffer GL | 15 ml |
Buffer GW1 (concentrate) | 13 ml |
Buffer GW2 (concentrate) | 15 ml |
Buffer GE | 15 ml |
Proteinase K | 25mg |
Proteinase K Storage Buffer | 1.25ml |
Spin Columns DM | |
With Collection Tubes | 50 |
【自备试剂】
无水乙醇
【实验准备】
1．向 Proteinase K 中加入 1.25 ml Proteinase K Storage Buffer 使其溶解，-20˚C 保存。
配制好的 Proteinase K 勿长时间室温放置，避免反复冻融，以免影响其活性。
2．样品应避免反复冻融，否则会导致提取的 DNA 片段较小且提取量也下降。
3．第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入无水乙醇。
4．使用前请检查 Buffer GTL 和 Buffer GL是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀，Buffer GTL 和 Buffer GL 于 56˚C 水浴重新溶解。
5．如果下游实验对 RNA 污染比较敏感，可以在加入 Buffer GTL 后加入 4 μl DNase-Free 的 RNase A（100 mg/ml）。
【不同海洋动物组织提取得率】
样本 | 建议孵育时间 | DNA 得率 | ||
贝类组织 | 0.5 h | 12-20 μg | ||
虾组织 | 1 h | 8-14 μg | ||
鱼组织 | 1 h | 15-40 μg | ||
【操作步骤】
1．取不超过 30 mg 组织材料，液氮充分研磨后，放入离心管（自备）中，加入 200 μl Buffer GTL，涡旋振荡 15 秒。
注意：1）根据提取的组织不同，起始量也有不同，腮的细胞量较大，一般建议提取量不超过 20 mg。
2）如需去除 RNA，可在上述步骤完成后，加入 4 μl 100 mg/ml 的 RNase A 溶液，震荡混匀，室温放置 5-10 分钟。
2．加入 20 μlProteinase K，涡旋混匀，简短离心，使管壁上的溶液收集到管底。56˚C 孵育，直至组织完全溶解，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：不同组织裂解时间不同，通常需 0.5-2 小时即可完成。对于难裂解组织可以适当延长孵育时间。
3．加入 200 μl Buffer GL，充分颠倒混匀，70˚C 孵育 10 分钟，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
注意：加入 Buffer GL 时可能会产生白色沉淀，一般 70˚C 放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取 DNA 量少和提取出的 DNA 不纯。
4．加入 200 μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能出现絮状沉淀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
5．将步骤 4 所得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱（Spin Columns DM）中，若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,000 rpm（～13,400×g）离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
6．向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW1（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
7．向吸附柱中加入 500 μl Buffer GW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如需进一步提高 DNA 纯度，可重复步骤 7。
8．12,000 rpm 离心 2 分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR 等）。
9．将吸附柱置于一个新的离心管中，向吸附柱中间部位悬空加入 50-200 μl Buffer GE，室温放置 2-5 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟，收集 DNA 溶液，-20˚C 保存 DNA。
注意：1）如果下游实验对 pH 值或 EDTA 敏感，可以用灭菌水洗脱。洗脱液的 pH 值对洗脱效率有很大影响，若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7.0-8.5（可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围），pH 值低于 7.0 时洗脱效率不高。
2）离心之前室温孵育 5 分钟可以增加产量。
3）用另外的 50-200 μl Buffer GE 或灭菌水再次洗脱可以增加产量。
4）如果要提高 DNA 的终浓度，可以将步骤 9 所得的 DNA 洗脱液重新加至吸附膜上，重复步骤 9；若洗脱体积小于 200 μl，可以增加 DNA 的终浓度，但可能会减少总产量。如果 DNA 的量小于 1 μg，推荐用 50 μl Buffer GE 或灭菌水洗脱。
5）因为保存在水中的 DNA 会受到酸性水解作用的影响，如需长期保存，推荐用 Buffer GE 洗脱并于-20˚C 保存。
【备注】
本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。