- 产品详情
- 产品参数
- 产品评论
M5 λ噬菌体基因组 DNA 快速提取试剂盒使用说明书
产品名称 | 单位 | 货号 | ||
M5 λ噬菌体基因组 DNA 快速提取试剂盒 50T | M666-01 | |||
【产品简介】
λ噬菌体载体广泛用于文库筛选，目的克隆培养获得大量的噬菌体颗粒需要提取λ噬菌体 DNA 来开展测序等后续工作。λ噬菌体裂解培养物离心后的上清，首先用 RNase A /DNase I 混合酶消化去除残留的宿主菌 DNA/RNA，沉淀收集噬菌体，噬菌体被 SDS 裂解，残留碎片通过沉淀离心去除掉。裂解物上清中的λ噬菌体 DNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，将盐、细胞代谢物、蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将λ噬菌体 DNA 从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】
1. 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。
2. 节省时间，简捷，可用于液体培养裂解物和固体培养板的提取，单个样品操作一般可在 1.5 小时内完成。
3. 产量高，典型的产量 10ml λ噬菌体裂解培养物上清可以提取约 10µg λ噬菌体 DNA。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280 典型的比值达 1.7～1.9。可以直接用来酶切和测序。
【产品组成】
试剂盒组成 | 保存 | 50 次 | |||
RNase A | -20℃ | 20 mg | |||
DNase I | -20℃ | 50 mg | |||
噬菌体沉淀液 | 室温 | 100 ml | |||
裂解缓冲液 | 室温 | 30 ml | |||
杂质沉淀液 | 室温 | 5 ml | |||
结合液 LB | 室温 | 20 ml | |||
漂洗液 WB | 室温 | 15 ml | |||
第一次使用前按说明加指定量乙醇 | |||||
洗脱缓冲液 EB | 室温 | 10 ml | |||
吸附柱 AC | 室温 | 50 个 | |||
收集管（2ml） | 室温 | 50 个 | |||
1. 在 RNase A 管和 DNase I 管分别加入 1 毫升的裂解缓冲液吹打，颠倒混匀，充分溶解 RNase A 和 DNase I 后，按照每次使用量分装－20℃冻存，有效期 6 个月。
2. 结合液 LB 低温时可能出现析出和沉淀，可以在 37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
3. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
【注意事项】
1. 使用转速可以达到 13,000rpm 的冷冻离心机。
2. 开始实验前将需要的水浴先预热到 37℃备用。
3. 需要自备氯仿，20％SDS。
4.结合液 LB 含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
【操作步骤】
提示：第一次使用前请先在漂洗液 WB 中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!将噬菌体沉淀液放在冰上预冷。
以 10 ml 噬菌体感染细菌培养上清提取举例：
1.将 0.5%氯仿处理后的λ噬菌体感染的液体培养物 10,000g（约 12,000rpm） 4℃离心 10 分钟去除细胞碎片和残渣。
转速不能过高，时间不能过长，否则噬菌体可能和碎片一起沉淀，降低产量。
2.取 10ml 上清，加入 20μl RNase 和 20μl DNase 充分混匀 37℃温育 30 分钟。
每个噬菌体培养上清因生长和裂解情况不同而残留 RNA/DNA 量不等。RNase/DNase 消化过头，可能减少产量；消化不完全，可能未消化的 DNA/RNA 和细胞碎片粘去部分噬菌体减低产量并/或者导致最后污染宿主菌 DNA，因此应该根据实际情况适当调节用量和消化时间。
3.加入 2 ml 冰预冷的噬菌体沉淀液，轻柔充分混匀后置冰上冷却（培养板裂解物必须在冰上放置 30 分钟）。
4.10,000g（12,000rpm）4℃离心 10 分钟，弃上清，干燥 1 分钟。沉淀下来的噬菌体外观为透亮或者稍白的沉淀。
5.加入 500μl 裂解缓冲液，吹打重悬噬菌体，加入 100μl 20％SDS，立即轻柔颠倒混匀 4-6 次后，70℃温育 10 分钟，然后置冰上冷却。
6.加入 100μl 杂质沉淀液，立即轻柔颠倒混匀 4-6 次，最高速 13,000g 4℃离心 10 分钟。
7.仔细将上清转入新的离心管，加入 350μl 结合液 LB，轻柔涡旋混匀。
8.将上述混合物加入一个吸附柱 AC 中，（吸附柱放入收集管中）12,000rpm 离心 30 秒，倒掉收集管中的废液。
吸附柱一次最多只可以容纳大约 700μl 混合物，因此需要分次把混合物上到吸附柱内，重复步骤 8。
9.加入 600μl 漂洗液 WB（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 秒，弃废液。
10. 可选步骤：重复步骤 9 一遍。
11. 将吸附柱 AC 放回空收集管中，13,000rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液， 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
12. 取出吸附柱 AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加 100μl 洗脱缓冲液 EB（洗脱缓冲液事先在 50℃水浴中预热），
室温放置 1 分钟，12,000rpm 离心 1 分钟。如果想得到较多量的 DNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，12,000rpm 离心 1 分钟。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要 DNA 浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于 40μl，体积过小降低 DNA 洗脱效率，减少 DNA 产量。
13. DNA 可以存放在 2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃。
问题与解决方法:
问题 | 评论与建议 | ||
* 试剂盒储存在非最佳条件-建议：收到试剂盒后总是存放在室温 | |||
（15℃-20℃）。 | |||
* 缓冲液或者试剂暴露于减少它们有效性的条件下-建议：储存在室温 | |||
（15℃-20℃），每次用完后立刻盖紧盖子，以免溶液蒸发，pH 改 | |||
变和污染。 | |||
* 漂洗液 WB 中忘记加无水乙醇-建议：第一次实验时，在漂洗液WB | |||
低核酸产量 | 中加入指定量无水乙醇。 | ||
或者纯度不高 | * 试剂和样品没有充分混匀-建议：加入每个试剂后都要充分混匀。 | ||
* 噬菌体上清滴度太低-建议：1.确认λ噬菌体已经完全裂解了宿主菌 | |||
（加入 0.5%的氯仿可以帮助完全裂解）；2.离心去除宿主菌碎片残 | |||
渣时间不能超过 10 分钟，转速不超过 10,000g，否则否则噬菌体也 | |||
可能和碎片一起沉淀丢失；3.重新培养一次噬菌体感染细菌。 | |||
* DNase I/RNase 消化不足或者过头-建议：消化过头，可能减少产量 | |||
并导致最后污染宿主菌 DNA；消化不完全，可能未消化的 DNA， | |||
RNA 和细胞碎片粘去部分噬菌体，因此可以适当调节用量。 | |||
宿主菌基因组 | * DNase I/RNase 失活或者反应条件不佳-建议：DNase I/RNase 必须 | ||
溶解在裂解缓冲液中，必须分装冻存。λ噬菌体必须用 LM(含镁离子) | |||
DNA 残留过高 | |||
培养，在其它培养肉汤中，DNase 消化活性可能受到影响。 | |||
* 不适合的离心温度和离心力。-建议：10,000g（12,000rpm）4℃离 | |||
加入噬菌体 | 心 10 分钟。 | ||
沉淀剂后未见到 | |||
* 上清中含λ噬菌体太少-建议：离心前，样品置冰上冷却。参见前面 | |||
λ噬菌体沉淀 | |||
滴度太低解决办法 | |||
*忘记做步骤 11，乙醇抑制了酶切反应-建议：做步骤 10，然后 | |||
空气中晾几分钟，让残留乙醇挥发。 | |||
*一些硅基质膜成分一起洗脱下来，抑制了酶切反应-建议：将洗 | |||
脱的基因组 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取上清使 | |||
DNA 下游酶切不能切 | |||
开或者酶切不完全 | 用。 | ||
*使用了错误的培养基培养λ噬菌体-建议：λ噬菌体必须用 LM(含 | |||
镁离子)培养，在其它培养肉汤中，DNA 酶切活性可能受到影响。 | |||
培养板培养必须用琼脂糖 Agarose 板，如果用琼脂 Agar 板，可 | |||
能抑制酶切。 | |||
纯化的 DNA | *一些硅基质膜成分一起洗脱下来，干扰了分光光度计读数-建 | ||
产物 D260 | 议：将洗脱的回收 DNA 溶液 13,000rpm 再离心一分钟，小心取 | ||
数值异常偏高 | 上清使用。 | ||