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M5 Universal Plus RNA Mini Kit 加强型组织/细胞 RNA 快速提取试剂盒使用说明书
产品名称 | 单位 | 货号 |
M5 Universal Plus RNA Mini Kit | 50T | MF167-01 |
【储存条件】
室温储存 12 个月不影响使用效果。本试剂盒所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，可在 37°C 水浴加热几分钟，恢复澄清后再使用。
【产品简介】
本公司独家推出 EASYspin 无苯酚、氯仿 RNA 快速提取技术基础上，又独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gDNA 残留，得到的 RNA 不需要 DNase 消化，可直接用于 PCR、荧光定量 PCR 等实验。独特的裂解液迅速裂解细胞和灭活细胞 RNA 酶，然后裂解混合物通过一个基因组 DNA 清除柱，基因组 DNA 被清除而 RNA 穿透滤过。滤过的 RNA 用乙醇调节结合条件后,RNA 在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除， 最后低盐的 RNase free water 将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。
【产品特色】
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。
2. 不需要苯酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀，快速方便，一般可在 30 分钟内完成。
3. 独家研发成功基因组 DNA 清除柱技术确保有效清除 gDNA 残留，得到的 RNA 不需要 DNase 消化，可直接用于 PCR、荧光定量 PCR 等实验。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD260/OD280典型的比值达 2.1-2.2，基本无 DNA 残留，可用于 RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。
【产品组份】
50T | 注意事项 | |
裂解液 RLT plus | 50 ml | 室温密闭干燥保存 |
去蛋白液 RW1 | 40 ml | 室温密闭干燥保存 |
漂洗液 RW | 10 ml | 初次使用前请按瓶标说明加入指定量的无水乙醇 |
70%乙醇 | 9 ml 瓶 | 提供 9ml RNase-Free H2O，使用前加入无水乙醇 |
RNase-Free H2O | 10 ml | 室温密闭干燥保存 |
基因组 DNA 清除套管 | 50 套 | 室温密闭干燥保存 |
RNase-Free 吸附套管 | 50 套 | 室温密闭干燥保存 |
【注意事项】
1. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13,000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
2. 样品处理量绝对不要超过基因组吸附柱 DA 和和 RNA 吸附柱 RA 处理能力，否则造成 DNA 残留或者产量降低。不同组织细胞种
类RNA/DNA 相差极大，例如胸腺脾脏 DNA 含量丰富，超过 5mg 就会超过柱子处理能力。COS 细胞 RNA 含量丰富，超过 3x106 细胞就会超过柱子吸附能力。所以开始摸索实验条件时，如果不清楚样品 DNA/RNA 含量时宁可使用较少的样品处理量，如细胞不超过 3-4x106，组织不超过 10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。
3.裂解液 RLTplus 和去蛋白液 RW1 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
4. 预防 RNase 污染，应注意以下几方面：
北京市昌平区回龙观龙域北街 10 号院 1 号楼四层 422-1 室（创集合大楼） 热线电话：（86）010-59724293
北京聚合美生物科技有限公司 Mei5 Biotechnology, Co., Ltd
1) 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染。
2) 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
3) RNA 在裂解液 RLT 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可
在150°C 烘烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。
4) 配制溶液应使用无 RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%( v/v)，37°C 放置过夜，高压灭菌。）
5. RNA 纯度及浓度检测：
完整性： RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳 (电泳条件：胶浓度 1.2%；0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟)检测完整性。由于细胞
中70%-80%的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带。动物 rRNA 大小分别约为 5 kb 和 2kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA。动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5-2.0 倍，否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
纯度：OD260/OD280比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD260/OD280读数（10mMTris,pH7.5）在 2.1-2.2 之间（100%纯的 RNA 比值一般是 2.2 左右，很多公司无法达到这个标准，所以 1.9-2.0 就凑合用了，但是我们的产品标准一般可以达到 2.1-2.2）。 OD260/OD280读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD260/OD280读数 1.8-2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5-1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。
浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase-Free 水稀释 n 倍，用 RNase-free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD260，OD280测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD260)×(稀释倍数 n)×40。
【操作步骤】
<实验前请先阅读注意事项，第一次使用前请先在漂洗液 RW 瓶和 70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇!>
1.组织培养细胞
a.收集<107悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。
b.13,000rpm 离心 10 秒（或者 300g 离心 5 分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。
c.轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入 350μl（<5x106细胞）或者 600μl（5x106-1x107细胞）裂解液 RLT plus，吹打混匀后用手剧烈振荡 20 秒，充分裂解。
d.用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物 5-10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆 30 秒),可以剪切DNA,降低粘稠度和提高产量。
e. 将裂解混合物或匀浆混合物全部加到 DNA 清除柱上（清除柱放在收集管内）。接操作步骤项下 3。
2.动物组织（例如鼠肝脑）
a. 电动匀浆：新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块，加入 350μl (<20mg 组织)或者 600μl(20-30mg 组织)的裂解液 RLT 后电动彻底匀
浆20-40 秒。
b.液氮研磨+匀浆：在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有 350μl/600μl 组织裂解液 RLTplus 的 1.5ml 离心管中, 用手剧烈振荡 20 秒，充分裂解。用带钝针头的一次性 1 ml(配 0.9mm 针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆 30 秒),可以剪切 DNA,降低粘稠度和提高产量。
c. 将匀浆后裂解物 13,000rpm 离心 3 分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部加到 DNA 清除柱上（清除柱放在收集管内）。
d. 接操作步骤项下 3。
3.立刻 13,000 rpm 离心 60 秒，保留滤过液（RNA 在滤过液中）。
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确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。
4.用微量移液器较精确估计滤过液体积（通常为 350μl/600μl，滤过时候损失体积应该减去）,加入等体积的 70%乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇!）,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心。
5.立刻将混合物(每次小于 700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
6.加 700μl 去蛋白液 RW1，室温放置 1 分钟，12，000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
7.加入 500μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μl 漂洗液 RW,重复一遍。
8.将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9.取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-50μl RNase free water（事先在70-90℃水浴中加热可提高产量），室温放置 1 分钟，12,000 rpm离心 1 分钟。
10. 如果预期 RNA 产量>30μg,加 30-50μl RNase free water 重复步骤 9, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度高)。
洗脱两遍的 RNA 洗脱液浓度高,分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15–30%,但是浓度要低,用户根据需要选择。