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M5 miRNA qPCR Assay Kit 使用说明书
本试剂盒须与miRNA cDNA第一链合成试剂盒（MF283-01）配套使用。
【储存条件】
长期保存，请置于-20˚C。
【产品简介】
本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光染料法的原理来进行miRNA荧光定量PCR检测。试剂盒包括检测所需的2×miRNA qPCR Mixture和Reverse Primer。
2×miRNA qPCRMixture是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，所含的荧光染料SYBR Green I可以与所有的双链DNA结合，使该产品可用于不同靶序列的检测而不需合成特异性标记探针。其中的GoldStar Taq DNApolymerase是经化学修饰的高效热启动酶，配合独特的缓冲体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内对miRNA进行准确定量。2×miRNA qPCR Mixture含有ROX染料，适用于需要ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。
【产品组份】
MF307-01
2× M5 miRNA qPCR Mixture（ROX） 2×750 μl
Reverse Primer, 10 μM 60 μl
ddH2O 1.5 ml
【自备实验材料】: qPCR上游引物（Forward primer）。
【Forward Primer设计原则】
1．遵循引物设计的最普遍原则。
2．以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础和最简单的设计方法。
3．试剂盒中提供的下游引物的Tm值为63.6℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在63.6℃左右。
4．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5’端添加几个碱基（最好为G或C碱基）；也可以在3’端添加1个或几个A碱基；或者5’端和3’端同时修饰。
5．若按照原则“2”的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5’或3’端去掉几个碱基。
【注意事项】
1．试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。
2．miRNA 第一链cDNA 的加入量不要超过Real time PCR 体积10%。
3．对于特殊的检测体系，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（稀释10倍或者100倍）。
4．本产品中的2×miRNA qPCR Mixture中含有SYBR Green I和ROX染料，保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。
5．避免反复冻融本品，反复冻融可能使产品性能下降，本产品长期保存可置于-20℃。如果在短期内需要频繁使用，2×miRNA qPCR Mixture可于2-8℃保存。而Reverse primer仍需置于-20℃保存。
【操作步骤】
1．室温融化2×miRNA qPCR Mixture和Reverse primer（10 μM）。
2．使用时请将2×miRNA qPCR Mixture上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降。
3．将试剂置于冰上，并按下表配制反应体系：
miRNA 第一链cDNA | X µl |
2x M5 miRNA qPCR Mixture（ROX） | 10 μl |
Primer 1 (10 μM) | 0.4 µl |
Primer 2 (10 μM) | 0.4 µl |
ddH2O补足至 | 20 µl |
建议的PCR条件（两步法）： | |
95°C 预变性 | 10 min. |
40-45 cycles of: | |
95°C 变性 | 15 sec. |
60°C 退火/延伸 | 1 min. |
融解曲线分析：根据PCR仪要求设定 | |
注意：1）本产品所采用的热启动酶须在预变性95℃、10 min条件下实现酶的活化。
2）退火温度请以60-64℃作为设定范围的参考，发生非特异性反应时，可提高退火温度。
【备注】
本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。