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M5 血清血浆 microRNA 提取试剂盒使用说明书
产品名称 | 单位 | 货号 |
M5 血清血浆 microRNA 提取试剂盒 | 50T | MF613-01 |
【储存条件】
室温
【产品简介】
对RNA 干扰和调节性小 RNA 的广泛研究迫切需要一种能有效提取 15¬-30 核苷酸左右大小 RNA（包括 siRNA 和 miRNA）的试剂盒。但是传统的 RNA 提取方法如硅胶膜不能有效吸附回收，酚/胍抽提和异丙醇或者乙醇沉淀并不能有效沉淀回收微小分子 RNA，对于血清血浆样本更是由于其自身特点更难提取。本试剂盒采用独特的裂解液迅速直接裂解血清血浆 RNA 酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA 包括微小分子 RNA 在高浓度乙醇下吸附于离心柱内特殊硅基质膜， 再通过一系列特殊漂洗液快速的漂洗－离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净 RNA 从硅基质膜上洗脱。
【产品特点】
1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 也不需要异丙醇或者乙醇沉淀等容易丧失微小分子 RNA 的步骤。
3. 特殊的裂解液配方，可以处理更多的血清/血浆样品。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，可用于 RNAi，RT-PCR，Northern-blot 和各种实验。
【产品组分】
试剂盒组成 | 保存 | 50T | |
Lysis buffer | 4°C 避光 | 50 ml | |
Wash Solution 1 | 室温 | 12 ml | |
第一次使用前加入 28ml 无水乙醇 | |||
Wash Solution 2/3 | 室温 | 10 ml | |
第一次使用前加入 42ml 无水乙醇 | |||
RNase-free H2O | 室温 | 10 ml | |
RNase-free吸附柱 RA 和收集管 | 室温 | 50 套 | |
1. 所有溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不能直接使用，可在 37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。
2. 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。
3. Wash Solution 2/3 可能加入乙醇使用几天后出现沉淀晶体，并不影响使用，直接不吸晶体，吸上清使用就可以。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
【注意事项】
1. 第一次使用前请先在 Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!
2. 除说明外，所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13，000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3. 需要自备乙醇，氯仿。
4.Lysis buffer 和 Wash Solution 1 含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5.RNA 纯度及浓度检测：
一般情况下通过测量 OD260 值可以知道 RNA 产量，测量 OD260/OD280 比值可以是衡量蛋白质污染程度的指标之一，但是由于血清/血浆的 RNA 含量特别低，已经低于分光光度计测量的下限，无法测量准确，因此一般无法通过测量 OD 值或者比值的方法来判断纯度或者浓度，只能通过下游做荧光定量 RT-PCR 来判断产量。同时无细胞的血清/血浆中的 RNA 主要是小于 100 nt 的小 RNA，因此传统的电泳检测 RNA 完整性并不适用于血清/血浆 RNA。
【操作流程】
提示：
第一次使用前请先在 Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入指定量乙醇！
1. 每 250μl 样品(血清，血浆)加入 750μl Lysis buffer，涡旋振荡或者用加样枪吹打液体样品几次混匀帮助裂解。
对于含有高污染物样品如高蛋白高血脂样品，可以适当减少处理量，不足的体积，可以用去 RNase-free H2O 补足。Lysis buffer 和液体样品的终体积比总是 3：1。例如 200μl 样品+50μl RNase-free H2O+750μl Lysis buffer。
2. 将样品剧烈震荡混匀，在 15 -30°C 条件下孵育 5 分钟。
3. 每750μl Lysis buffer 加 200μl 氯仿，剧烈振荡 15 秒并室温下放置 2 分钟。
4.于 4℃12,000rpm 离心 10 分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 存在于水相中。水相层的容量大约为所加 Lysis buffer 体积的 70%。
5.小心取上清（精确计算体积）转入到新的离心管，加入 1.5 倍体积的无水乙醇（必须是室温的），涡旋混匀。此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心，立刻接下步。
6. 将混合物(每次小于 700μl,多可以分两次加入)加入一个吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）12,000 rpm离心 30-60 秒，弃掉废液。
7. 加 700μl Wash Solution 1（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
8. 加入 500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μlWash Solution 2/3，
重复一遍。
9. 将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10. 取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30-40μl RNase free water（事先在
100℃水浴中预热效果更好）， 室温放置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。
洗脱液加回到吸附柱重复洗脱一遍可以提高产量和浓度(如果需要 RNA 浓度高)。如果需要提高浓度，洗脱体积最小可以低至 15μl，但是使用小体积洗脱会降低一些产量。
【备注】
本产品仅供科研使用。在确认产品质量出现问题时，本公司承诺为客户免费更换等量的质量合格产品。